Tip:
Highlight text to annotate it
X
Bienvenue à la série visuelle Protocole Novus.
Dans cette vidéo, nous allons apprendre à effectuer toutes les phases d'un Western Blot en utilisant le
méthodes les plus courantes pour cette analyse.
Avant que nous puissions commencer à préparer la tache, nous devons d'abord préparer notre lysat échantillon.
Dans cet exemple, nous allons préparer un lysat de protéine à partir de cellules en culture.
Ici
nous laver les cellules deux fois avec du PBS glacé
et un *** de lyse assez pour couvrir les cellules.
Le choix de *** de lyse dépend largement de votre
choix de la protéine d'intérêt.
Nous gratter les cellules et transférer la solution de cellules sur un tube de centrifugeuse
placé sur la glace.
Afin de solubiliser les protéines liées à la membrane, nous aurons besoin de plus forte
détergents extraction par rapport aux protéines cytoplasmiques isolées.
Dans cet exemple,
nous utilisons un *** RIPA standard,
qui est un *** commun pour l'obtention d'un rendement maximum de protéines. Lors de l'extraction
protéines de toutes localisations cellulaires,
il est très important d'inclure des inhibiteurs de protéase dans votre *** de lyse qui sera
prévenir la dégradation de l'échantillon. Toujours utiliser la protéase fraîchement préparée
inhibiteurs, conserver les échantillons sur la glace et de travailler rapidement.
Nous pou les cellules par pipetage de haut en bas
suivie d'une incubation sur la glace pendant 30 minutes.
Centrifuger les cellules en un culot.
Jeter le culot et recueillir le surnageant. Ceci est votre lysat.
Déterminer la concentration totale de votre lysat de protéine par
tester une petite partie de votre lysat
avec un dosage de protéine de quantification disponibles dans le commerce
tels que la BCA.
Cela vous aidera à charger des quantités égales de protéines dans votre gel.
Western Blots sont traditionnellement préformé en vertu réduite et dénaturée
conditions. Ces conditions permettent d'être séparé des protéines par leur
poids moléculaire
plutôt que de leur forme native conformationnelle ou la charge.
Pour réduire et dénaturer les échantillons,
diluer chacun dans un *** de charge tel que le *** Laemmli traditionnelle.
Ce *** contient du bêta-mercaptoéthanol, ou DTT, afin de réduire le disulfure de
entre les cystéines,
SDS pour aider dénaturation d'une protéine net négatif,
glycérol pour permettre aux échantillons de sombrer dans chaque puits,
bleu de bromophénol pour visualiser le lysat et un *** emblématique.
Votex chaque échantillon et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour
complètement dénaturer les protéines. Vous êtes maintenant prêt à charger vos échantillons dans un
dans un gel SDS-PAGE.
Pour cette prochaine étape, nous allons séparer les protéines individuelles dans notre échantillon
lysat
sur la base de leur poids moléculaire
à l'aide d'une électrode positive pour attirer une protéine chargée négativement.
Pour ce faire,
nous chargeons nos échantillons de protéines préalablement préparés dans un commerce
gel de polyacrylamide.
Les gels sont disponibles en pourcentages fixes ou des gradients d'acrylamide.
Plus le acrylamide plus la proportion de gel
pourcentage.
Par conséquent gels de pourcentage plus élevés sont meilleurs pour les protéines de faible poids, faible pourcentage
gels sont plus grandes pour les protéines de poids et des gels de gradient peut être utilisé pour
protéines de toutes tailles
raison de leur gamme variant en taille des pores.
Préparez votre gel en l'insérant dans l'appareil d'électrophorèse et
remplissage avec *** de migration qui est approprié pour votre chimie gel.
Rincer les puits du gel avec un *** en cours d'exécution et ajouter un *** à l'
chambres.
Chargez vos échantillons dans les puits.
Si vous n'êtes pas sûr de la quantité à charger,
10-30 microgrammes de protéine totale est un point de départ suggéré
ainsi que la totalité de l'échantillon chargé.
Vous aurez aussi besoin de réserver au moins un puits de poids moléculaire pré-colorés
échelle.
L'échelle vous permettra de contrôler la séparation des protéines au cours
électrophorèse, puis vérifier le poids de protéines dans votre échantillon pendant
analyse ultérieure.
Fermez l'unité d'électrophorèse et le connecter à une source d'alimentation. La plupart des unités
fonctionnent généralement 45-60 minutes à 200 volts
ou jusqu'à ce que le *** de charge atteint le bas du gel.
Pendant ce temps, les protéines chargées négativement dans chaque échantillon vont migrer vers
l'électrode chargée positivement leur chemin à travers le polyacrylamide
matrice de gel.
Dans cette nouvelle étape, nous allons transférer nos protéines séparées sur le gel
et dans une membrane solide ou par transfert.
Ceci est basé sur le même principe que l'étape précédente
dans lequel un champ électrique est chargé d'éliminer les protéines négatifs
vers une électrode positive.
Le transfert peut se produire dans des conditions humides ou semi-sèche.
Ici, nous allons démontrer la méthode traditionnelle de transfert humide. Commencez par enlever
le gel de la cassette
couper la partie supérieure contenant le puits.
Notch dans le coin supérieur gauche de l'orientation gel indiqué.
Flotter le gel dans un *** de transfert pendant la préparation du sandwich de transfert.
Pour faire le sandwich de transfert
vous aurez besoin d'une cassette,
éponge, le papier filtre
le gel
et votre choix de PVDF ou de la membrane cellulo.
PVDF doit d'abord être activé par trempage de la membrane dans de l'éthanol pour
deux minutes. Mais en dehors de ce PVDF ou le choix de cellulo
membrane est une préférence personnelle.
Notch dans le coin supérieur gauche pour indiquer l'orientation blot
et incuber des membranes dans un *** de transfert pour 10 minutes.
Créer une pile en plaçant les composants suivants
de la cathode vers l'anode négatif noir positif rouge:
éponge,
papier filtre,
membrane,
(Attention à ne pas toucher le gel ou la membrane avec vos mains nues et l'utilisation
pince à épiler propre ou spatule lieu.
Toucher la membrane pendant toute phase peut contaminer la tache et conduire à
signal de fond excessif. ),
papier filtre
et une éponge.
Utiliser un rouleau propre à chaque couche de rouler doucement les bulles qui peuvent être
présenter
depuis bulles va inhiber la protéine de transfert efficace.
Verrouiller la cassette et l'introduire dans l'appareil contenant froid
transférer ***
faire en sorte que la cassette est correctement positionné du négatif au positif.
Afin d'éviter l'accumulation de chaleur, il est avantageux de transférer un rhume
emballez-le dans l'appareil
Appareil ou dans une chambre froide à la centrifugeuse barre placée au fond de la chambre.
Fermer la chambre et se connecter à une source d'alimentation.
Effectuer le transfert selon les instructions du fabricant qui est
normalement 100 volts pour 30 à 120 minutes.
Après électrotransfert de nos protéines sur une membrane, nous
désormais bloquer la tache,
appliquer un anticorps spécifique primaire pour notre protéine d'intérêt et secondaire
anticorps qui reconnaissent l'anticorps primaire.
Commencer par retirer la membrane de la cassette et le rinçage à l'eau trois fois.
En option, nous pouvons vérifier les protéines ont été transférées avec succès
par coloration de la membrane avec rouge ponceau.
Incuber la membrane dans le ponceau pendant cinq minutes et laver avec de l'eau jusqu'à ce que
les bandes sont claires.
Après vérification
la tache peut alors être dé-taché en continuant de se laver avec de l'eau
ou du SCT ficelle
jusqu'à ce que le colorant est complètement enlevé.
Nous avons besoin de bloquer tous les domaines de la tache qui ne contiennent pas de protéines.
Cela permettra d'éviter une liaison non spécifique de l'anticorps et de réduire globalement
fond du signal.
Communs tampons de blocage comprennent 5% de lait écrémé sec pour le dosage
dans une solution de TBS ficelle.
Cependant, ne pas utiliser de lait durant la sonde avec des anticorps phospho spécifiques
car il peut causer de fond élevé de son phosphoprotéine endogène, le césium.
Incuber la membrane avec une solution de blocage pendant une heure à chambre
température
sous légère agitation.
Décanter la solution de blocage et laver avec du TBS ficelle pour cinq minutes.
Nous sommes maintenant prêt à ajouter notre anticorps. Diluer l'anticorps primaire dans un
*** de blocage à la concentration recommandée dans la fiche technique.
Incuber une nuit à 4 degrés Celsius avec agitation douce.
Une étape recommandée option est d'utiliser également un anticorps contrôle positif
ce qui permet à l'utilisateur de vérifier des quantités égales de protéines totales ont été chargés dans
chaque puits et les aides au dépannage en éliminant toute
incertitudes avec la technique de Western Blot.
Le lendemain,
décanter l'anticorps primaire et laver la membrane avec de grands volumes
du SCT ficelle et une agitation vigoureuse
cinq fois pendant cinq minutes chacun.
Ces lavages strictes sont extrêmement importants pour l'élimination non spécifique
signaux de fond.
Après le lavage, diluer l'anticorps secondaire dans une solution de blocage et incuber
la membrane pendant une heure à la température ambiante à la concentration
recommandé sur la fiche technique.
Dans notre exemple, le secondaire est également conjugué à HRP pour plus ***
détection.
Membrane Décanter et lavage secondaire avec de grands volumes de TBS avec ficelle
agitation vigoureuse cinq fois pendant cinq minutes chacun.
Vous êtes maintenant prêt pour la phase de détection.
Dans cette phase finale, nous allons démontrer le développement du signal en utilisant la plus courante,
méthode de détection la plus sensible et la plus économique de l'électrochimioluminescence
(Ou ECL) de réaction.
Cette méthode utilise l'enzyme HRP,
qui a été conjugué à la secondaire pour catalyser la réaction ECL et produire
lumière.
Une lumière est ensuite recueillie sur un film radiographique et développé
ou numérisées à l'aide d'une caméra spéciale assez sensibles
pour cette application.
Nous commençons en mélangeant des parties égales des réactifs ECL dans un rapport de un-à-un
conformément aux instructions du fabricant.
Nous incuber la membrane pendant 3-5 minutes sans agitation.
Après incubation, le mélange décanter ECL et l'utilisation d'un laboratoire lingette pour essuyer le surplus
solution à partir du coin de la membrane.
Placer la membrane dans une pellicule de plastique transparent tel qu'une feuille de protection pour éviter
séchage. Évitez de laisser la membrane sécher complètement.
Nous pouvons maintenant utiliser un rouleau pour faire sortir toutes les bulles ou tout excès de solution.
Élaborer immédiatement la membrane.
Les deux systèmes de film et la caméra vous permet de régler manuellement la durée d'exposition
afin d'assurer une image parfaite de l'Ouest Blot.
Densités relatives des bandes peuvent maintenant être quantifiée avec disponible dans le commerce
logiciel.
. Bon poids moléculaire peut également être vérifiée en comparant tailles des bandes à l'
échelle de poids moléculaire.