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En deuxième jour de notre procédure de la CPI, nous allons ajouter notre anticorps secondaire, effectuez
un étiquetage facultatif double et étape de marquage nucléaire,
monter nos lamelles sur des lames, et obtenir des images de nos anticorps avec
un microscope à fluorescence.
Premier
on aspire hors primaire suivant solution d'anticorps par lavage des cellules
trois fois avec du PBST pendant cinq minutes chacun.
Préparer le prochain floraform anticorps secondaire conjugué qui se lie à
l'anticorps primaire.
Diluer le *** de blocage secondaire
à la dilution recommandent spécifié sur la fiche
et incuber à température ambiante pendant une heure.
Couvrant les plaques avec du papier empêche colorants sensibles de se dégrader.
Aspirer la solution d'anticorps secondaire suivie d'un lavage des cellules
trois fois avec du PBST
pendant cinq minutes chacun.
En option une paire séparée primaire et secondaire peut être utilisé
de visualiser un second épitope en utilisant un étage différent pour lui.
En outre, les colorants liaison à l'ADN tels que DAPI peut être appliqué sans la nécessité d'
Anticorps secondaires.
Reportez-vous au Protocole Novus écrite pour obtenir les instructions sur la façon de doubler et
étiquette triple.
Lamelles couvre êtes maintenant prêt à être monté sur des lames de microscope.
Prenez une lame propre et déposer une goutte de milieu de montage en antifade lentement
numérotation vers le bas le piston de la pipette.
Retirez délicatement une lamelle du puits,
permettent de lavage en excès de s'égoutter
et placer les cellules face vers le bas sur la lame.
Vernis à ongles transparent peut être utilisé pour sceller la lamelle et l'empêcher de
sécher.
Les diapositives peuvent maintenant être visualisées sous un microscope ou stockés à -20
ou 4 degrés Celsius dans une boîte à lames sombre ou coulissant livre.
Limiter la quantité de temps chaque diapositive est exposé à la lumière du microscope nous aideront
pour prolonger le signal fluorescent
et empêcher photoblanchiment.