Tip:
Highlight text to annotate it
X
Avec les cellules ensemencées le jour précédent et du jour au lendemain culture, nous sommes prêts
à commencer par la procédure de la CPI.
En ce premier jour de la CCI, nous allons corriger,
perméabiliser,
effacer et ajouter un anticorps primaire aux cellules.
Commencer par aspiration du milieu de culture de chaque puits suivi par la fixation de l'
cellules avec du formaldéhyde 4% ou 10% de formol
pendant 10 minutes à température ambiante.
Aspirer et rincer fixateur chaque puits deux fois avec du PBS glacé.
Veillez à ne pas laisser les cellules se dessèchent dans ce
ou toute autre étape du protocole.
Si l'épitope de votre protéine d'intérêt est exprimée au niveau intracellulaire,
perméabilisation cellulaire est nécessaire pour l'anticorps à avoir accès à l'
cellule.
Bien qu'il existe de nombreux agents de perméabilisation différentes, dont les plus courantes
sont .1 - concentration .5% de Tween-20 ou
Triton-X100
dilué dans du PBS.
Tween-20 est utilisé pour des épitopes situés dans le cytoplasme
tandis que Triton-X100 est utilisé pour perméabilisant le noyau et les mitochondries.
Incuber les puits avec un *** de perméabilisation pendant 10 minutes à température ambiante.
Aspirer *** de perméabilisation et laver trois fois pendant 5 minutes
chacun avec PBS ficelle.
PBS ficelle contient 0,1% de Tween-20.
Nous allons maintenant bloquer les sites de liaison non spécifiques avec un *** de blocage pendant 1 heure
à la température ambiante.
Le *** de blocage est meilleur PBST contenant 10% de sérum de la
accueillir les espèces de votre anticorps secondaire.
Toutefois, 1% de BSA dans du PBST peuvent également être utilisés.
Préparer l'anticorps primaire par dilution dans du *** de blocage à l'®
dilution indiquée sur la fiche technique.
Plusieurs dilutions plus strictes sont bénéfiques pour tenir compte des variables qui
peut être différent dans votre analyse et
pour atteindre les meilleurs résultats.
Incuber à 4 degrés Celsius la nuit.
Dans notre exemple, nous utilisons une primaire non conjuguée, nous allons utiliser un fluorophore
secondaire conjugué à la deuxième journée.