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Après électrotransfert de nos protéines sur une membrane, nous allons bloquer l'
effacer,
appliquer un anticorps spécifique primaire pour notre protéine d'intérêt, puis un anticorps secondaire
qui reconnaît l'anticorps primaire.
Commencer par retirer la membrane de la cassette et de rinçage à trois reprises en
de l'eau.
En option, nous pouvons vérifier les protéines ont été transférées avec succès
par coloration de la membrane avec rouge ponceau.
Incuber la membrane dans le ponceau pendant cinq minutes et laver avec de l'eau jusqu'à ce que
les bandes sont claires.
Après vérification de l'empreinte peut alors être dé-taché en continuant de se laver avec
de l'eau ou du SCT ficelle jusqu'à ce que le colorant est complètement enlevé.
Nous avons besoin de bloquer tous les domaines de la tache qui ne contient pas déjà protéines.
Cela permettra d'éviter une liaison non spécifique de l'anticorps et de réduire globalement
fond du signal.
Communs tampons de blocage comprennent 5% de lait écrémé sec pour le dosage
dans une solution de TBS ficelle.
Cependant, ne pas utiliser de lait durant la sonde avec des anticorps phospho spécifiques que possible
provoquer de fond élevé de son phosphoprotéine endogène, le césium.
Incuber la membrane avec une solution de blocage pendant une heure à température ambiante
sous légère agitation.
Décanter la solution de blocage et laver avec du TBS ficelle pour cinq minutes.
Nous sommes maintenant prêt à ajouter notre anticorps. Diluer l'anticorps primaire dans un
*** de blocage à la concentration recommandée dans la fiche technique.
Incuber une nuit à 4 degrés Celsius avec agitation douce.
Une étape recommandée option est d'utiliser également un contrôle positif d'anticorps chargé
ce qui permet à l'utilisateur de vérifier des quantités égales de protéines totales ont été chargés dans chaque
puits et aides dans le dépannage en éliminant toute incertitude
avec la technique de Western Blot. Le lendemain, décanter l'anticorps primaire et
laver la membrane avec de grands volumes de TBS ficelle et une agitation vigoureuse
cinq fois pendant cinq minutes chacun.
Ces lavages strictes sont extrêmement importants pour l'élimination non spécifique
signaux de fond.
Après le lavage, diluer l'anticorps secondaire dans une solution de blocage et
incuber la membrane pendant une heure à la température ambiante à la concentration
recommandé sur la fiche technique.
Dans notre exemple, le secondaire est également conjugué à HRP pour plus ***
détection.
Membrane Décanter et lavage secondaire avec de grands volumes de TBS avec ficelle
agitation vigoureuse cinq fois pendant cinq minutes chacun. Vous êtes maintenant prêt pour l'
détection de phase.