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Bienvenue à la série visuelle Protocole Novus.
Dans cette vidéo, nous allons apprendre à effectuer toutes les phases d'un Western Blot en utilisant le
méthodes les plus courantes pour cette analyse.
Avant que nous puissions commencer à préparer la tache, nous devons d'abord préparer notre lysat échantillon.
Dans cet exemple, nous allons préparer un lysat de protéine à partir de cellules en culture.
Ici, nous laver les cellules deux fois avec du PBS glacé et un *** de lyse assez
à couvrir les cellules.
Le choix de *** de lyse dépend largement de la localisation
de votre protéine d'intérêt.
Nous gratter les cellules et transférer la solution de cellules sur un tube de centrifugeuse
placé sur la glace.
Afin de solubiliser les protéines liées à la membrane, nous aurons besoin de plus forte
détergents extraction par rapport aux protéines cytoplasmiques isolées.
Dans cet exemple, nous utilisons un *** RIPA standard, qui est un *** commun
pour obtenir un rendement maximum de protéines. Lors de l'extraction des protéines à partir de tous les
localisations cellulaires,
il est très important d'inclure des inhibiteurs de protéase dans votre *** de lyse qui sera
prévenir la dégradation de l'échantillon. Toujours utiliser la protéase fraîchement préparée
inhibiteurs, conserver les échantillons sur la glace et de travailler rapidement.
Nous pou les cellules par pipetage de haut en bas
suivie d'une incubation sur la glace pendant 30 minutes.
Centrifuger les cellules en un culot.
Jeter le culot et recueillir le surnageant. Ceci est votre lysat.
Déterminer la concentration totale en protéines de votre lysat échantillon par
tester une petite portion du lysat avec une protéine disponible dans le commerce
analyse quantitative tels que la BCA.
Cela vous aidera à charger des quantités égales de protéines dans votre gel.
Western Blots sont traditionnellement préformé en vertu réduite et dénaturée
conditions.
Ces conditions permettent d'être séparé des protéines selon leur poids moléculaire
plutôt que de leur forme native conformationnelle ou la charge.
Pour réduire et dénaturer les échantillons,
diluer chacun dans un *** de charge tel que le *** Laemmli traditionnelle.
Ce *** contient du bêta-mercaptoéthanol, ou DTT, afin de réduire le disulfure de
crêtes entre cystéines,
SDS dénaturant pour aider a fournir une protéine net négatif,
glycérol pour permettre aux échantillons de sombrer dans chaque puits,
bleu de bromophénol pour visualiser le lysat
et un *** emblématique.
Votex chaque échantillon et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour
complètement dénaturer les protéines. Vous êtes maintenant prêt à charger vos échantillons dans un
SDS-PAGE sur gel.