Tip:
Highlight text to annotate it
X
Bienvenue sur la série visuelle des Protocoles Novus.
Dans cette vidéo, vous allez apprendre à réaliser toutes les étapes de l'immunocytochimie
fluorescente
avec les méthodes les plus couramment utilisées pour cette application.
Avant de commencer la procédure d'ICC, nous allons vous montrer comment préparer
les lamelles et les plaques de culture cellulaire.
Commencer par traiter les lamelles avec de l'acide chlorhydrique 1Mchlorhydrique pour
pendant 24 heures.
Après avoir soigneusement décanter et retirer l'acide des lamelles de verre,
laver chaque lamelle avec de l'eau distillée
suivi d'un rinçage final à l'éthanol.
Optionnellement, vous pouvez placer les lamelles dans un support pour les
submerger
dans une solution de 0.1 mg de gélatine ou de polylysine
pendant cinq minutes.
Ces traitements permettent de fournir une meilleure adhérence des cellules aux
lamelles
Et aident à prévenir leur détachement pas pendant les étapes de lavage ultérieures.
sécher ensuite les lamelles sous
la hotte ou dans l'incubateur
les lamelles sèches sont ensuite placées dans chaque puits d'une
plaque de culture de 6 puits
Recouvrir ensuite d'un couvercle.
Pour gagner du temps, plusieurs plaques peuvent être préparées à l'avance pour une utilisation ultérieure.
Les plaques peuvent également être stérilisées en les plaçant sous une lumière UV de la hotte.
Avec les lamelles propres préparées dans les 6 puits,
nous pouvons maintenant ajouter nos cellules.
Ajouter les cellules pour une obtenir une densité d'un demi-million de cellules par puits.
Les cellules sont ensuite cultivées pendant une nuit dans un incubateur ou jusqu'à ce qu'elles atteignent leur densité
optimale
Les cellules ensemencées le jour précédent et cultivées pendant une nuit, sont maintenant prêtes
pour la procédure d'ICC.
Le premier jour de l'ICC, nous allons fixer,
perméabiliser,
et ajouter un anticorps primaire aux cellules.
Commencer par l'aspiration du milieu de culture dans chaque puits suivi de la fixation des
cellules avec du formaldéhyde 4% ou formol 10%
pendant 10 minutes à température ambiante.
Aspirer le fixateur et rincer 2 fois chaque puits avec du PBS glacé.
Veillez à ne pas laisser les cellules se dessécher
à aucun moment du protocole.
Si l'épitope de votre protéine d'intérêt est exprimée au niveau intracellulaire,
la perméabilisation cellulaire est nécessaire pour permettre l'accès de anticorps à
cellule.
Bien qu'il existe de nombreux
réactifs de perméabilisation, les plus courants sont le
tween
0,1% à 0,5%
ou le Triton-X100
dilué dans du PBS.
Tween-20 est utilisé pour les épitopes cytoplasmiques
tandis que le Triton-X100 est utilisé pour perméabiliser le noyau et les mitochondries.
Incuber les puits avec le *** de perméabilisation pendant 10 minutes à température ambiante.
Aspirer *** de perméabilisation et laver trois fois 5 minutes avec
du PBS Twine.
Le PBS Twine contient 0,1% de Tween-20.
Nous allons maintenant bloquer les sites de liaison non spécifiques en utilisant un *** de blocage pendant 1 heure
à température ambiante.
Le meilleur *** de blocage est le PBST contenant 10% de sérum de l'espèce hôte
de l' anticorps secondaire.
Cependant,
Une solution de BSA à 1% dans du PBST peut également être utilisée.
Préparer l'anticorps primaire en le diluant dans du *** de blocage
à la dilution recommandée sur la fiche technique.
Plusieurs dilutions plus étroites sont recommandées pour tenir compte des différentes variables
de votre test
et afin obtenir de meilleurs résultats.
Incuber à 4 degrés C une nuit.
Dans notre exemple,
Alors que nous utilisons un anticorps primaire non conjugué, nous allons aussi utiliser un anticorps
secondaire conjugué à un fluorophore le deuxième jour.
Au deuxième jour de notre procédure d' ICC
nous allons donc ajouter l'anticorps secondaire,
effectuer un double marquage facultatif, une étape de marquage nucléaire,
monter des lamelles sur les lames,
et visualiser les marquages avec un microscope à fluorescence.
Nous allons d'abord Aspirer la solution d'anticorps primaire puis laver les cellules
3 fois avec du PBST pendant cinq minutes.
Préparer en suite l'anticorps secondaire conjugué au floraform. Ce cernier va se lier à
L'anticorps primaire.
Diluer le secondaire dans le *** de blocage
avec la dilution recommandée sur la fiche technique
et incuber a température ambiante pendant une heure.
Recouvrir les plaques avec du papier aluminium pour prévenir de la dégradation des colorants photo-sensibles.
Aspirer la solution d'anticorps secondaire et laver les cellules
3 fois avec du PBST
pendant cinq minutes.
En étape facultative une deuxième paire d'anticorps primaire et secondaire peut être utilisée
pour visualiser un deuxième épitope
à l'aide d'un autre étage pour celui-ci.
En outre, les colorants de liaison d'ADN tels que DAPI
Peut-être appliqués sans avoir recours a l'utilisation d'anticorps secondaires.
Reportez-vous au Protocole écrit pour obtenir les instructions sur la façon de réaliser des double et
triple marquages.
Les lamelles peuvent maintenant être montées sur des lames de microscope.
Prenez une lame propre et déposer une goutte de milieu de montage antifade lentement
En faisait tourner manuellement le piston de la pipette.
Retirez délicatement une lamelle du puit,
Laisser égoutter l'excès de *** de lavage
et placer les cellules faisant face vers le bas sur la lame.
Du vernis à ongles transparent peut être utilisé pour sceller la lamelle et l'empêcher de
sécher.
Les lames peuvent maintenant être visualisées au microscope
ou stockés à -20 C ou 4 C
dans une boîte à lames sombre ou livre à lames.
Limiter le temps d'exposition des lames à la lumière du microscope afin
de prolonger le signal fluorescent
et d'éviter le photo-blanchiment.